ゲノム決定されている魚類のリスト

全ゲノムがすでに決定されている動物のリストから。ここでは魚類（おもにTeleost fishes）に注目。

Wikipediaから。魚類は11種（シーラカンス含む、軟骨魚類と円口類は含まない）。

List of sequenced animal genomes - Wikipedia, the free encyclopedia

Ensembl Genome Browserから。魚類は11種。Species treeで見た方が目的の種を探しやすいかも。
http://www.ensembl.org/info/about/species.html

面白いことに、WikipediaとEnsemblとでは構成種が違います。WikipediaではElectric eel（デンキウナギですね）やRainbow trout（ニジマス）が含まれる一方、Ensemblに登録されているBlind cavefish（洞窟にすむ目のないサカナ、カラシン類）やTilapia（ティラピア、日本語ではカワスズメ、シクリッド類）が含まれない。

クロマグロThunnus orientalisはどちらにも載っていません。使いやすいgenome browserが存在しないからかな（データはGenbankから入手可能）。論文はこちら。

でも、一番タイムリーに情報が得られるのは、NCBI Genomeデータベースの検索かもしれません。例えば検索ワードを"Teleostei"とすると、49件hitします。"Fishes"だと57件で、もう少し多いです。ただし、どちらのワードでもミトゲノムだけ、というのもhitするので、この49-57はちょっと過大かもしれません。

MiSeqデータのMHC領域へのマッピング（14）：Variant Effect PredictorによるSNPのアノテーション（その3）

2015-05-18

ここでは、Variant Effect Predictorで得られたアノテーション情報を含むVCF formatファイルをダウンロードして、Rで読み込む方法を解説します。

4. アノテーション情報を含むVCFファイルをダウンロードする

解析結果の画面（前回の内容参照）で、設定部分の右側"Download"（下図）から、"VCF"をクリックします。

ダウンロードされるファイルを別名で保存します。ここでは"MHC_test4.var.annotated.vcf"とします。このファイルをCotEditorなどで開くとわかりますが、このファイルは改行コードがCR/LFになっているので、Terminal等で開くことも考えて、LFに変換しておきます。

ちなみに"Download"の下の方に見えている"Excel file"のような絵（上図）をクリックすると、.csv形式でファイルが保存され、Excelで開くことができます（Excelを使う場合、これも悪くない）。

5. アノテーション付き".vcf"ファイルをRで読み込む

ダウンロードしたVCFファイル"MHC_test4.var.annotated.vcf"は、Rで読み込むことができます。ただし、Rに読み込む前に一手間かける必要があります。

(1) まず、"MHC_test4.var.annotated.vcf"をCotEditorで開きます。

(2) 「検索」メニューから「検索…」を選択します。

(3)「検索と置換」ウィンドウの「正規表現」をチェックし、検索文字列の窓（上）に"\t"と入力、置換文字列の窓（下）に"|"と入力します（下図）。「すべて置換」をクリックして、"MHC_test4.var.annotated.vcf"のすべてのtabを"|"に変換します。

(4) ファイルを上書き保存します。改行コードがLFになっていることを確認。

(5) Rを起動し、「その他」- 「作業ディレクトリの変更…」で、"MHC_test4.var.annotated.vcf"のあるディレクトリを選択します。

(6) 以下のコマンドで、"MHC_test4.var.annotated.vcf"の内容をRに読み込みます。

MHC_test4_annotated <- read.table("MHC_test4.var.annotated.vcf",header=F, sep="|")

エラーが出なければ、以下のコマンドで読み込まれていることを確認します。

head(MHC_test4_annotated, 10)

• • • • • • • -

データを読み込めれば、Rを使ってTableの必要な部分のみを抜き出したり、特定の遺伝子や特定のタイプの変異を選択的に得ることができます。

たとえば、"HLA_DPB1"のSNPのうち、アミノ酸を変えるもの (missense_variant)のみを抜き出したい！　という場合には、

HLA_DPB1_missense <- subset(MHC_test4_annotated,V11=="HLA-DPB1" & V9=="missense_variant")

とします。

条件に一致するSNP数をカウントするには

length(HLA_DPB1_missense[,1])

とします。

MiSeqデータのMHC領域へのマッピング（13）：Variant Effect PredictorによるSNPのアノテーション（その2）

2015-05-18

Variant Effect PredictorによるSNPのアノテーション結果について説明します。

3. アノテーション結果を見る

(1) Summary statistics
解析がうまく行くと、このような結果の画面を見ることができます。

ここでの表と円グラフは、結果全体の要約になっています。"Consequences (all)"は、遺伝子以外の領域も含めたすべてのSNPの位置の存在比率を、"Coding consequences"は遺伝子コード領域のSNPにおける同義・非同義、ナンセンス変異などの存在比率を示しています。

(2) 結果の絞り込み
これら"Summary statistics"の下の部分には、各SNP（多型）ごとのアノテーション結果が、表として示されています。ただし、SNPの数が多い場合には、結果そのままの状態では必要な情報を得ることが難しいです。そこで、表の上にある設定を行う部分（下図）を使用して、必要なSNP情報の絞り込みや、必要なデータのダウンロードを行います。

"Navigation"では、一度に表示するSNPsの数を選択します。Defaultでは5になっているので、もっと多く表示したい場合は、50などに変更します。ただし、SNPsの数が多い（1000以上あるような）場合に"all"を選択してしまうと、表示に時間がかかってしまう場合があります。

次に、結果の表の各列について説明します。

Consequence: 多型variantがどのようなタイプの変異を引き起こすのか、についての情報です。intron_variantはintron内の変異、synonymous_variantは同義変異（アミノ酸を変えないコード領域内の変異：コドンの3rd positionの多くや1st positionの一部の変異）、missense_variantはアミノ酸を変える変異、upstream_gene_variantは遺伝子上流（5' UTRなど）の変異、splice_region_variantはexon-intron境界のsplicing siteに生じた変異、stop_gainedはナンセンス変異になります。
Impact: SNPの表現型に対する影響？　LOWは表現型にはあまり関係ない（同義変異など）、MODERATEはある程度関係する（アミノ酸置換など）、MODIFIERは現時点ではわかりません（<--あとで調べること）。
Gene: ENSEMBL gene IDのようです。リンクになっています。
Amino acids, Codons: コード領域のSNPについて、アミノ酸（ミスセンス変異の場合）およびコドンの変異を示しています。
Existing variations: そのSNPが既知の変異に対応する場合、そのSNP IDなどへのリンク。
SIFT: アミノ酸配列の変異が、タンパク質の機能に与える影響を予測するアルゴリズム。予測の方法は、類似した配列を持つ複数のタンパク質の配列の比較に基づいているらしい（詳細はWeb siteを参照）。有害な（deleterious）あるいは許容されない（intolerant）変異は赤で表示されます。
PolyPhen: SIFTと同様に、coding領域の変異がタンパク質の機能に与える影響を予測するツール。SIFTより情報量が多いように見えます。（Website）。
GMAF: 1000 Genomes projectのデータにおけるminor alleleの頻度
AFR-MAF, etc.（その後8列）：1000 Genomes projectで調べられている人類集団ごとのSNP allele頻度（existing allele --> majorなほうのallele?）。

これら各列の情報をもとに、表の上部にある設定部分の"Filters"（以下）を使って、必要な情報の絞り込みを行います。

"Consequence"が"missense_variant"である多型のみを表示したい場合、"Uploaded variation"のプルダウンメニューから"Consequence"を選択し、"is" はそのままで、入力部分に"missense_variant"と入力して、"add"をクリックします。

データが絞り込まれ、上のようにFilter（絞り込み）の内容が表示されます。ここから、さらに絞り込むことができます。たとえば、missense_variantのうち、PolyPhemの数値が0.9より大きいものを見たい場合は、"Uploaded variation"のプルダウンメニューから"PolyPhem"を選択し、"is"から">"を選択し、入力欄に0.9を入力して、"add"をクリックします。

Filterの条件を変えるときは、条件の右にある鉛筆を、Filterを削除する場合は、×をクリックします。

アノテーション結果のダウンロード、Rでの編集については、次回に続きます。

MiSeqデータのMHC領域へのマッピング（12）：Variant Effect PredictorによるSNPのアノテーション（その1）

2015-05-18

以下の記事も参考にしています。

ショートリードの憂鬱 - 次世代シーケンサー: Ensembl - Variant Effect Predictor でSNPアノテーション

ここでは、データをリファレンスにマッピングすることで得られた多型（SNP）サイト（7回目の内容も参照）の情報について、個々のSNPに付随する情報（ゲノム上の位置、遺伝子、exon or intron, 同義 or 非同義置換、ミスセンス／ナンセンス変異など）、また既知のSNP IDと一致するかどうかなどを得る方法を説明します。ここでは、VCF formatで示された多型サイト情報を使用します。

1. Variant Effect Predictor

Variant Effect PredictorはEnsemblが提供するウェブ上の多型アノテーションツールで、ヒト多型サイトについて以下のような情報を得ることができます。

• 多型によって影響される遺伝子 (gene)または転写産物 (transcript)
• 多型の位置 (e.g.転写産物の上流, コード領域, non-coding RNA, 調節領域)
• タンパク質コード領域に与える影響 (e.g. 終止コドンの生成, アミノ酸の置換, 終止コドンの喪失, フレームシフト)
• 既知のSNPにおけるSNP ID, 1000 genome project から見つかったSNPのminor allele頻度
• タンパク質配列の変化に対するSIFT及びPolyPhen scores（<-- あとで説明）

2. Variant Effect Predictorを実行する

(1) まず、"Launch"をクリックします。
(2) 入力画面に行きます。以前に他の解析を行っている場合は、以前の結果に対するリンクが出るので、その場合は"New JEP job"をクリックします。
(3) "Or upload file"で「ファイルを選択」します。ここでは7回目で作った"MHC_test4.var.vcf"を選択します。
(4) 結果のフィルタリングをします。"Filters"の"Restrict results"の部分で、"Show one selected consequence per variant"を選択します。これを選択しないと、1つのSNPについて複数のアノテーションが出てしまい、見づらいです。
(5) "Run >"をクリックして解析を実行します。

解析結果の解釈は次のエントリで説明します。

RNA-Seqデータを用いた系統解析 (1): 解析の方針

RNA-Seqで得られる多数の異なる遺伝子座のデータをもとに系統推定をする方法について、以下では考えていきます。以下には、解析の方針を箇条書きにしてみます（変更の可能性あり）。

(1) RNA-Seqによるデータの入手（Illumina MiSeqなどを使用）

(2) Reference配列の作成（非モデル生物の場合：Trinityによるde novo assembly）

(3) Reference配列に対する近縁種データのマッピング（STAMPYを使用）

(4) Mapping結果からcontigを抽出（samtoolsを使用）、contigのquality checkなど

(5) Contigのアラインメント、遺伝子の読み枠（open reading frame, ORF）の同定、BLAST検索によるアノテーション（いくつかのPerl scriptを使用）

(6) すべてのcontigを統合したデータから系統樹を作成する（RAxMLを使用）

(7) Bayesian concordance analysisによるconcordance treeの作成、種系統樹と異なる分岐を示す遺伝子の同定（BUCKyなどを使用）

以下のような内容でまとめていきます。

解析を行う上でのサンプルデータは、Evolutionの以下の論文（Cui et al. 2013）で発表されたXiphophorus fishの複数種データを使用する予定です。解析の流れについても、大体この論文を参考にしています。データはここからダウンロードできます（.sra file）。Brain由来のRNA-Seq readのデータ（Illumina HiSeq 2000による）になります。